Quantificação de NAD+ e seus metabólitos em nervos ciáticos de camundongos
Introdução
As partes cruciais do dinucleotídeo nicotinamida adenina (NAD+) e seus metabólitos no envelhecimento e na neurodegeneração foram amplamente reconhecidas. Para estimular o progresso em direção à pesquisa bioquímica e intervenções voltadas para o envelhecimento e doenças neurodegenerativas, é de grande importância quantificar com precisão o NAD + e seus níveis de metabólitos na via de resgate do NAD +. Aqui, um método LC-MS/MS robusto e preciso é aplicado para quantificar os níveis de NAD+ e seus metabólitos no nervo ciático de camundongo normal e lesionado.
Limitações dos métodos existentes para quantificar o NAD+ e seus metabólitos
Os métodos tradicionais para quantificar o NAD+ e seus metabólitos, como HPLC-UV, RMN, eletroforese de zona capilar ou ensaios enzimáticos colorimétricos, enfrentam vários desafios de sensibilidade, seletividade e medição indireta. Quanto aos ensaios LC-MS/MS existentes para medições de NAD+ celular ou tecidual e seus metabólitos, ainda há muitas dificuldades a serem superadas, como tempos de execução prolongados, comportamento de retenção cromatográfica ruim e formas de pico insatisfatórias. Além disso, apenas uma a três substâncias na via de salvamento NAD+ podem ser cobertas por esses métodos.
As modificações do método LC-MS/MS
Com base nos ensaios LC-MS/MS existentes, são realizadas as modificações relativas às condições cromatográficas, à matriz substituta e às condições MS/MS. Especificamente, 5 μM de ácido metileno fosfônico são empregados como aditivo de fase móvel, que promove explicitamente a intensidade do sinal e a forma do pico. Dada a natureza relativamente limpa e simples das amostras nunca e seu pequeno tamanho, a água ultrapura é testada como uma matriz substituta. Em vez de coluna de cromatografia líquida de interação hidrofílica e coluna de hipercarbeto, é utilizada a coluna Waters Atlantis Premier BEH C18 AX, cuja tecnologia exclusiva de superfície de alto desempenho MaxPeak HPS (passivando a parede interna da coluna, eliminando a superfície metálica) permite a alta reprodutibilidade, simetria de pico e separação de linha de base de todos os analitos.Além disso, as condições de MS são otimizadas para minimizar o sinal de interferência NAD + no canal cíclico de adenosina difosfato ribose (cADPR), mantendo a resposta de cADPR e mononucleotídeo de nicotinamida (NMN), com 4000V para tensão de pulverização de íons, 450 ° C para temperatura do turbo aquecedor, 50 psi para Gás 1, 50 psi para Gás 2, 30 psi para gás de cortina e 12 psi para gás de colisão.
Cromatograma representativo de amostras de nervos (normal vs lesionado)
Todos os cinco analitos atingem a separação basal, onde o cADPR é um biomarcador sensível no modelo de neurodegeneração. Aqui, a axotomia do nervo ciático induz degeneração axonal, levando à redução do nível de NAD + e ao nível elevado de NMN nos nervos lesados, resultando em um aumento de cerca de 2 vezes na relação NMN / NAD +. Simultaneamente, os níveis de nicotinamida (NAM) e adenosina difosfato ribose (ADPR) diminuem cerca de 2 vezes, enquanto o nível de cADPR aumenta em mais de 8 vezes. Esses resultados são consistentes com os de pesquisas relatadas anteriormente, verificando a precisão desse método modificado de LS-MS/MS na quantificação de NAD+ e seus metabólitos.
Conclusão
Este método LC-MS/MS modificado permite a separação basal eficaz de NAD+, NMN, NAM, ADPR e cADPR em um breve tempo de execução de 5 minutos, o que contribui para diagnósticos precoces de vários distúrbios neurológicos e desenvolvimento de medicamentos para envelhecimento e doenças neurodegenerativas.
Referência
Ma Y, Deng L, Du Z. Desenvolvimento e validação de um método LC-MS/MS para quantificar NAD+ e metabólitos relacionados em nervos ciáticos de camundongos e sua aplicação a um modelo animal de lesão nervosa. J Chromatogr A. doi:10.1016/j.chroma.2024.464821
BONTAC NAD
BONTAC dedica-se à P&D, fabricação e venda de matérias-primas para coenzima e produtos naturais desde 2012, com fábricas próprias, mais de 170 patentes globais, bem como forte equipe de P&D. A BONTAC possui uma rica experiência em P&D e tecnologia avançada na biossíntese de NAD e seus precursores (por exemplo. NMN e NR). Existem vários tipos de NAD a serem selecionados, abrangendo NAD ER Grau (remoção de endoxina), NAD Grau I (IVD / suplemento dietético / cosméticos em pó cru), NAD Grau II (API / intermediários) e NAD Grau IV (se houver maior requisito de solubilidade), que pode ser fornecido na forma de pó liofilizado ou pó cristalino. A pureza do BONTAC NAD pode chegar a mais de 98%.
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