Engenharia enzimática acoplada ao crescimento por meio da manipulação da regeneração de cofator redox

Uma gama cada vez maior de produtos químicos está sendo produzida a partir de matérias-primas renováveis por meios biotecnológicos. Os bioprocessos dependem fortemente da catálise enzimática para a produção eficiente desses compostos. Garantir que as enzimas funcionem de forma ideal em seu ambiente necessário é, portanto, de grande interesse para a produção sustentável.

Propriedades como especificidade do substrato, taxa catalisadora e (termo)estabilidade estão entre vários fatores críticos que devem ser otimizados para bioprocessos eficientes impulsionados por enzimas. Essa otimização pode ser demorada, custosa e desafiadora, e, portanto, formas eficazes e econômicas prováveis para seleção acoplada ao crescimento, enzimas de engenharia com características desejáveis são muito procuradas.

As vantagens de usar a seleção acoplada ao crescimento como uma forma de seleção enzimática, que envolve ligar a atividade de uma enzima ao crescimento de uma célula. Esse método pode ser usado como uma estratégia de seleção de alta capacidade e pode ser alcançado garantindo que o crescimento dependa da síntese do produto pela enzima-alvo ou vinculando a atividade da enzima ao estado energético global da célula. A biologia sintética pode ser usada para criar cepas adequadas para seleção acoplada ao crescimento, e avanços recentes têm se concentrado em engenharia de cepas deficientes nos estados oxidados ou reduzidos dos pares de cofatores redox, que podem servir como plataformas de engenharia enzimática. O uso dessas plataformas pode acelerar o desenvolvimento de biocatalisadores e bioprocessos aprimorados.

Benefícios do acoplamento de crescimento via auxotrofia de cofatores

Os benefícios do uso da auxotrofia dos cofatores como método de seleção para enzimas de engenharia envolvidas na biossíntese de certos produtos químicos, como lipídios, biocombustíveis, gases, solventes orgânicos ou compostos poliméricos. Essa abordagem oferece vários benefícios únicos, incluindo a capacidade de selecionar o produto desejado independentemente do substrato ou produto de interesse, facilitando a detecção de maior atividade enzimática e oferecendo um letreiro para detectar a melhoria da atividade enzimática. Além disso, o uso de auxótrofos cofatores como plataformas de acoplamento de crescimento é benéfico porque a natureza onipresente dos cofatores redox no metabolismo microbiano significa que estratégias de engenharia podem ser transferíveis lateralmente para outros microrganismos de interesse, e enzimas podem ser diretamente engenheiradas no ambiente do hospedeiro microbiano desejado. (mostrado como Figura 1)

Figura 1: Comparação de várias técnicas amplamente utilizadas de triagem/seleção para engenharia enzimática

Mutantes deficientes em oxidação de NADH

A oxidação do NADH em E. coli pode ocorrer por duas vias, dependendo da disponibilidade de oxigênio. Em condições aeróbicas, o NADH é oxidado principalmente por respiração para gerar ATP, enquanto em condições anaeróbicas, pode ser oxidado por via de fermentação para produzir lactato e etanol. Cepas mutantes de E. coli, incapazes de usar vias de fermentação mistas para oxidação do NADH durante o crescimento anaeróbico, têm sido usadas para impulsionar vias oxidantes de NADH para a síntese anaeróbia de vários produtos químicos, como 2-metilpropano-1-ol, 2,3-butanediol, 1-butanol e L-alanina. Essas cepas mutantes também foram usadas para engenheirar enzimas explorando princípios redox semelhantes, resultando em variantes aprimoradas. As cepas resultantes podem ser usadas para engenheirar outras enzimas e vias dependentes de NAD(P)H.

Mutantes deficientes na redução de NAD+  

Wenk et al. criaram uma cepa de E. coli ao eliminar o gene dihidrolipoil desidrogenase (lpd), o que resultou na incapacidade da cepa de gerar poder redutor (NADH e NADPH) a partir do metabolismo do acetato devido à ausência de atividade de piruvato desidrogenase. Isso fazia com que a deformação apresentasse auxotrofia para reduzir a potência quando cultivada aeróbicamente sobre acetato como única fonte de carbono. (mostrado como Figura 2) A cepa pôde crescer em acetato quando suplementada com substratos glicolíticos superiores ou ao expressar desidrogenases de formiate, etanol ou metanol dependentes de NAD+ com seus respectivos substratos. A cepa não foi usada para engenharia enzimática e foi avaliada apenas para auxotrofia do cofator redox.
 

Figura 2: Metabolismo Central 

Mutantes deficientes na oxidação por NADPH

Existem duas estratégias diferentes para induzir a auxotrofia de NADP+ em E. coli, baseando-se na engenharia da via glicolítica para produzir NADPH em excesso. A primeira estratégia envolve a exclusão do gene nativo gapA e a expressão de uma enzima GAPDH dependente de NADP+ heterólogo, enquanto a segunda estratégia envolve redirecionar o fluxo de carbono pela via do fosfato pentose. As cepas resultantes não conseguem crescer na glicose, mas apresentam crescimento em diferentes condições, sendo a primeira cepa cultivada em condições anaeróbias e a segunda em condições aeróbias com glicerol como substrato. Essas cepas são usadas para engenharia de enzimas com propriedades aprimoradas, incluindo especificidade de substrato, atividade catalítica e termoestabilidade.

Mutantes deficientes na redução de NADP+

Três bactérias diferentes, E. coli, P. putida e C. glutamicum, foram modificadas para serem NADPH-auxotróficas, o que significa que precisam de NADPH exógeno para crescer. No caso de E. coli e C. glutamicum, enzimas metabólicas centrais foram eliminadas para evitar a redução do NADP+ quando a glicose foi fornecida como fonte de carbono, enquanto em P. putida, a engenharia assistida por CRISPR/nCas9 foi usada para interromper conjuntos de genes-alvo sequencialmente e entender seu envolvimento no metabolismo redox. As cepas NADPH-auxotróficas foram então usadas para engenharia enzimática acoplada ao crescimento baseada na especificidade de cofatores. Uma única rodada de mutagênese usando E. coli resultou na desidrogenase de formatiato dependente de NADP+ mais eficiente e específica até o momento, enquanto P. putida e C. glutamicum representam as primeiras cepas de sua espécie que podem ser usadas para esse tipo de engenharia.

Mutantes deficientes na redução de NMN+

Um sistema de seleção acoplado ao crescimento foi desenvolvido para ligar o ciclo dos cofatores ao crescimento com base em uma deficiência na redução do NMN+. Foi usada a cepa SHuffle de E. coli, que carrega deleções em dois genes envolvidos na produção de glutationa reduzida. Uma glutationa redutase dependente de NMNH foi desenvolvida por meio de mutagênese racional para ligar o processo ao ciclo NMN+/NMNH, e uma desidrogenase de glicose dependente de NMN+ foi usada para apoiar o ciclo dos cofatores NMN+/NMNH e, portanto, o crescimento. O estudo também aplicou pela primeira vez a auxotrofia do cofator redox não canônico para a engenharia enzimática acoplada ao crescimento, resultando em uma variante termoestável de fosfito desidrogenase com eficiência catalítica e estabilidade temporal aprimoradas in vitro. O trabalho fornece uma deformação útil para engenharia enzimática acoplada ao crescimento, dependente do ciclo NMN+/NMNH e auxotrófica para o estado reduzido de um cofator redox não canônico.

O potencial do acoplamento de crescimento por meio de cofatores redox atuou como uma ferramenta poderosa para engenharia de biocatalisadores, especialmente no contexto da bioprodução sustentável. Embora avanços consideráveis tenham sido feitos na geração de cepas auxotróficas de cofatores redox, a declaração sugere que ainda existem várias vias inexploradas para pesquisa. Uma delas envolve a engenharia de cepas auxotróficas cofatorais de organismos diferentes de E. coli, o que pode abrir novas possibilidades para a engenharia enzimática acoplada ao crescimento.

No geral, sugere que o uso do acoplamento de crescimento baseado em cofatores redox representa uma grande oportunidade para engenharia de biocatálise, especialmente para a produção de produtos que não podem satisfazer os requisitos de outras abordagens de engenharia enzimática de alto rendimento. Enfatiza a necessidade de desenvolver biocatalisadores mais versáteis e eficientes para a bioprodução sustentável e ressalta a importância da pesquisa contínua nessa área.


Referência: Jochem R. Nielsen a, Ruud A. Weusthuis b, Wei E. Huang a, Engenharia enzimática acoplada ao crescimento por meio da manipulação da regeneração de cofator redox, Biotechnology Advances, 2023.