Engenharia enzimática acoplada ao crescimento através da manipulação da regeneração do cofator redox

Uma gama cada vez mais vasta de produtos químicos está agora a ser produzida a partir de matérias-primas renováveis através de meios biotecnológicos. Os bioprocessos dependem fortemente da catálise enzimática para a produção eficiente desses compostos. Garantir que as enzimas tenham um desempenho ideal em seu ambiente necessário é, portanto, de alto interesse para a produção sustentável.

Propriedades como especificidade do substrato, taxa catalítica e (termo)estabilidade estão entre vários fatores críticos que devem ser otimizados para bioprocessos eficientes impulsionados por enzimas. Essa otimização pode ser demorada, dispendiosa e desafiadora e, portanto, maneiras eficazes e econômicas provavelmente para a seleção acoplada ao crescimento, enzimas de engenharia com características desejáveis são altamente procuradas.

As vantagens de usar a seleção acoplada ao crescimento como uma forma de seleção enzimática, que envolve a ligação da atividade de uma enzima ao crescimento de uma célula. Este método pode ser usado como uma estratégia de seleção de alto rendimento e pode ser alcançado garantindo que o crescimento seja dependente da síntese do produto pela enzima alvo ou ligando a atividade da enzima ao estado energético global da célula. A biologia sintética pode ser usada para projetar cepas adequadas para a seleção acoplada ao crescimento, e avanços recentes se concentraram em cepas de engenharia deficientes nos estados oxidados ou reduzidos dos pares de cofatores redox, que podem servir como plataformas de engenharia enzimática. O uso dessas plataformas pode acelerar o desenvolvimento de biocatalisadores e bioprocessos aprimorados.

Benefícios do acoplamento de crescimento via auxotrofia de cofator

Os benefícios do uso da auxotrofia de cofator como um método de seleção para enzimas de engenharia envolvidas na biossíntese de certos produtos químicos, como lipídios, biocombustíveis, gases, solventes orgânicos ou compostos poliméricos. Essa abordagem oferece vários benefícios exclusivos, incluindo a capacidade de selecionar o produto desejado independentemente do substrato ou produto de interesse, facilitando a detecção de atividade enzimática aprimorada e oferecendo uma leitura para detectar atividade enzimática aprimorada. Além disso, o uso de auxotróficos de cofatores como plataformas de acoplamento de crescimento é benéfico porque a natureza onipresente dos cofatores redox no metabolismo microbiano significa que as estratégias de engenharia podem ser lateralmente transferíveis para outros micróbios de interesse, e as enzimas podem ser diretamente projetadas dentro do ambiente do hospedeiro microbiano desejado. (mostrado como figura 1)

Figura 1: Comparação de várias técnicas de triagem/seleção amplamente utilizadas para engenharia enzimática

Mutantes deficientes em oxidação de NADH

A oxidação do NADH em E. coli pode ocorrer por duas vias, dependendo da disponibilidade de oxigênio. Sob condições aeróbicas, o NADH é oxidado principalmente através da respiração para gerar ATP, enquanto sob condições anaeróbicas, pode ser oxidado através de vias de fermentação para produzir lactato e etanol. Cepas mutantes de E. coli, incapazes de usar vias de fermentação mistas para oxidação de NADH durante o crescimento anaeróbio, têm sido usadas para conduzir vias oxidantes de NADH para a síntese anaeróbia de vários produtos químicos, como 2-metilpropano-1-ol, 2,3-butanodiol, 1-butanol e L-alanina. Essas cepas mutantes também têm sido usadas para projetar enzimas, explorando princípios redox semelhantes, resultando em variantes melhoradas. As cepas resultantes podem ser usadas para projetar outras enzimas e vias dependentes de NAD(P)H.

Mutantes deficientes em redução de NAD+

Wenk et al. criaram uma cepa de E. coli excluindo o gene da dihidrolipoíla desidrogenase (lpd), o que resultou na cepa ser incapaz de gerar poder redutor (NADH e NADPH) a partir do metabolismo do acetato devido à ausência de atividade da piruvato desidrogenase. Isso fez com que a cepa exibisse auxotrofia para reduzir a potência quando cultivada aerobicamente em acetato como única fonte de carbono. (mostrado como figura 2) A cepa foi capaz de crescer em acetato quando suplementada com substratos glicolíticos superiores ou ao expressar desidrogenases de formato dependente de NAD+, etanol ou metanol com seus respectivos substratos. A cepa não foi utilizada para engenharia enzimática e só foi avaliada para auxotrofia do cofator redox.
 

Figura 2: Metabolismo Central

Mutantes deficientes na oxidação do NADPH

Existem duas estratégias diferentes para induzir a auxotrofia NADP+ em E. coli, contando com a engenharia da via glicolítica para superproduzir NADPH. A primeira estratégia envolve a exclusão do gene gapA nativo e a expressão de uma enzima GAPDH heterologa dependente de NADP+, enquanto a segunda estratégia envolve o redirecionamento do fluxo de carbono através da via da pentose fosfato. As cepas resultantes são incapazes de crescer em glicose, mas exibem crescimento em diferentes condições, com a primeira cepa cultivada em condições anaeróbias e a segunda em condições aeróbicas com glicerol como substrato. Essas cepas são usadas para engenharia de enzimas com propriedades melhoradas, incluindo especificidade do substrato, atividade catalítica e termoestabilidade.

Mutantes deficientes na redução do NADP+

Três bactérias diferentes, E. coli, P. putida e C. glutamicum, foram projetadas para serem NADPH-auxotróficas, o que significa que requerem NADPH exógeno para o crescimento. No caso de E. coli e C. glutamicum, as enzimas metabólicas centrais foram eliminadas para evitar a redução da NADP+ quando a glicose foi fornecida como fonte de carbono, enquanto em P. putida, a engenharia assistida por CRISPR/nCas9 foi usada para interromper conjuntos de genes-alvo sequencialmente para entender seu envolvimento no metabolismo redox. As cepas NADPH-auxotróficas foram então usadas para engenharia enzimática acoplada ao crescimento com base na especificidade do cofator. Uma única rodada de mutagênese usando E. coli produziu o formato desidrogenase dependente de NADP+ mais eficiente e específico até o momento, enquanto P. putida e C. glutamicum representam as primeiras cepas de suas espécies que podem ser usadas para esse tipo de engenharia.

Mutantes deficientes em redução de NMN+

Um sistema de seleção acoplado ao crescimento foi desenvolvido para vincular o ciclo de cofatores e o crescimento com base em uma deficiência na redução de NMN +. Utilizou-se a cepa SHuffle de E. coli, que carrega deleções em dois genes envolvidos na produção de glutationa reduzida. Uma glutationa redutase dependente de NMNH foi desenvolvida através de mutagênese racional para vincular o processo ao ciclo NMN+/NMNH, e uma glicose desidrogenase dependente de NMN+ foi usada para apoiar o ciclo do cofator NMN+/NMNH e, portanto, o crescimento. O estudo também aplicou auxotrofia de cofator redox não canônico para engenharia enzimática acoplada ao crescimento pela primeira vez, resultando em uma variante termoestável de fosfito desidrogenase com melhor eficiência catalítica e estabilidade temporal in vitro. O trabalho fornece uma cepa útil para a engenharia enzimática acoplada ao crescimento, dependente do ciclo NMN+/NMNH e auxotrófica para o estado reduzido de um cofator redox não canônico.

 

O potencial de acoplamento de crescimento via cofatores redox funcionou como uma ferramenta poderosa para projetar biocatalisadores, particularmente no contexto da bioprodução sustentável. Embora um progresso considerável tenha sido feito na geração de cepas auxotróficas de cofator redox, a declaração sugere que ainda existem vários caminhos inexplorados para a pesquisa. Uma delas envolve a engenharia de cepas auxotróficas de cofatores de outros organismos além de E. coli, o que poderia abrir novas possibilidades para a engenharia enzimática acoplada ao crescimento.

No geral, sugere que o uso de acoplamento de crescimento baseado em cofator redox representa uma grande oportunidade para a biocatálise de engenharia, particularmente para a produção de produtos que não podem satisfazer os requisitos de outras abordagens de engenharia enzimática de alto rendimento. Enfatiza a necessidade de desenvolver biocatalisadores mais versáteis e eficientes para a bioprodução sustentável e ressalta a importância da pesquisa contínua nessa área.


Referência: Jochem R. Nielsen a, Ruud A. Weusthuis b, Wei E. Huang a, Engenharia enzimática acoplada ao crescimento através da manipulação da regeneração de cofatores redox, Biotechnology Advances, 2023.