Quantificação do NAD+ e seus Metabólitos nos Nervos Ciáticos do Camundongo
Introdução
As partes cruciais da nicotinamida adenina dinucleotídea (NAD+) e seus metabólitos no envelhecimento e neurodegeneração têm sido amplamente reconhecidas. Para impulsionar o progresso em pesquisas bioquímicas e intervenções voltadas para o envelhecimento e doenças neurodegenerativas, é de grande importância quantificar com precisão o NAD+ e seus níveis de metabólitos na via de salvamento do NAD+. Aqui, é aplicado um método robusto e preciso LC-MS/MS para quantificar NAD+ e seus níveis de metabólitos no nervo ciático de camundongos normal e lesionado.Limitações dos métodos existentes para quantificar NAD+ e seus metabólitos
Métodos tradicionais para quantificar NAD+ e seus metabólitos, como HPLC-UV, NMR, eletroforese de zona capilar ou ensaios enzimáticos colorimétricos, enfrentam diversos desafios em sensibilidade, seletividade e medição indireta. Quanto aos ensaios LC-MS/MS existentes para NAD+ celular ou tecidular e suas medições de metabólitos, ainda há muitas dificuldades a serem superadas, como tempos de funcionamento prolongados, comportamento de retenção cromatográfica ruim e formas de pico insatisfatórias. Além disso, apenas uma a três substâncias na via de salvamento NAD+ podem ser cobertas por esses métodos.As modificações do método LC-MS/MS
On the basis of existing LC-MS/MS assays, the modifications regarding the chromatographic conditions, surrogate matrix and MS/MS conditions are conducted. Specifically, 5 μM of methylene phosphonic acid is employed as the mobile phase additive, which explicitly promotes the signal intensity and peak shape. Given the relatively clean and simple nature of never samples and their small size, ultrapure water is tested as a substitute matrix. Instead of hydrophilic interaction liquid chromatography column and hypercarb column, the Waters Atlantis Premier BEH C18 AX column is utilized, whose unique MaxPeak HPS high-performance surface technology (passivating the column inner wall, eliminating metal surface) enables the high reproducibility, peak symmetry, and baseline separation of all analytes. Além disso, as condições da EM são otimizadas para minimizar o sinal de interferência NAD+ no canal cíclico de adenosina difosfato ribose (cADPR), mantendo a resposta do cADPR e do mononucleotídeo nicotinamida (NMN), com 4000V para tensão de pulverização iônica, 450°C para temperatura do turboaquecedor, 50 psi para Gás 1, 50 psi para Gás 2, 30 psi para gás cortina e 12 psi para gás de colisão.
Cromatografia representativa de amostras de nervos (normais vs lesionados)
Todos os cinco analitos alcançam separação basal, onde o cADPR é um biomarcador sensível no modelo de neurodegeneração. Aqui, a axotomia do nervo ciático induz degeneração axonal, levando à redução do nível de NAD+ e elevação do nível de NMN nos nervos lesionados, resultando em um aumento de cerca de 2 vezes na razão NMN/NAD+. Simultaneamente, os níveis de nicotinamida (NAM) e ribose-difosfato de adenosina (ADPR) diminuem cerca de 2 vezes, enquanto o nível de cADPR aumenta mais de 8 vezes. Esses resultados são consistentes com os de pesquisas previamente relatadas, verificando a precisão desse método LS-MS/MS modificado na quantificação do NAD+ e seus metabólitos.
Conclusão
Esse método modificado de LC-MS/MS permite a separação efetiva de base de NAD+, NMN, NAM, ADPR e cADPR em um curto tempo de execução de 5 minutos, o que contribui para o diagnóstico precoce de vários distúrbios neurológicos e para o desenvolvimento de medicamentos para doenças do envelhecimento e neurodegenerativas.Referência
Ma Y, Deng L, Du Z. Desenvolvimento e validação de um método LC-MS/MS para quantificar NAD+ e metabólitos relacionados em nervos ciáticos de camundongos e sua aplicação a um modelo animal de lesão nervosa. J Chromatogr A. doi:10.1016/j.chroma.2024.464821BONTAC NAD
BONTAC dedica-se à P&D, fabricação e venda de matérias-primas para coenzimas e produtos naturais desde 2012, com fábricas próprias, mais de 170 patentes globais, além de uma forte equipe de P&D. O BONTAC possui vasta experiência em P&D e tecnologia avançada na biossíntese de NAD e seus predecessores (ex. NMN e NR). Existem vários tipos de NAD a serem selecionados, incluindo NAD Grau ER (remoção de endoxina), NAD Grau I (IVD/suplemento alimentar/pó cru cosmético), NAD Grau II (API/intermediários) e NAD Grau IV (caso haja maior necessidade de solubilidade), que podem ser fornecidos na forma de pó liofilizado ou pó cristalino. A pureza do NAD BONTAC pode ultrapassar 98%.
