A Otimização das Condições de Reação para Alcançar Alto Rendimento de Stevia Rebaudioside D
Dietas ricas em açúcar levaram a um aumento da prevalência de várias doenças crônicas, incluindo obesidade, diabetes, doenças cardiovasculares e hipertensão, representando uma preocupação significativa de saúde pública global. Stevia Rebaudioside D (Reb D), um adoçante natural derivado de plantas, ganhou grande atenção como substituto do açúcar devido ao seu teor zero calórico, doçura intensa e perfil de sabor agradável.
No entanto, sua presença limitada na stevia rebaudiana Bertoni e os desafios relacionados à baixa solubilidade e atividade enzimática da glicosiltransferase de origem vegetal dificultaram sua ampla aplicação comercial. Em resposta a essas questões, foi descoberta uma nova glicosiltransferase chamada YojK, originária do Bacillus subtilis 168. Este estudo introduz uma glicosiltransferase bacteriana geneticamente modificada, YojK-I241T/G327N, caracterizada por alta solubilidade e eficiência catalítica, oferecendo grande potencial para a produção em escala industrial de Reb D.
O desenvolvimento de um método altamente eficiente para a produção de rebaudisídeo D utilizando uma reação em cascata das enzimas YojK-I241T/G327N e AtSuSy.
Para abordar a questão da baixa solubilidade em glicosiltransferases derivadas de plantas, pesquisadores investigaram o potencial do uso de YojK, uma O-glicosiltransferase do Bacillus subtilis 168. O YojK foi escolhido por sua demonstrada atividade de glicosilação com vários substratos, incluindo moléculas grandes. Após expressão recombinante bem-sucedida e purificação, YojK foi empregado para glicosilar Reb A, resultando na produção de Stevia Reb D. A análise cinética enzimática revelou que YojK tem menor atividade catalítica em relação a Reb D em comparação com outras glicosiltransferases. Consequentemente, o estudo sugere a necessidade de engenharia guiada por estruturas para aprimorar a atividade catalítica do YojK para potenciais aplicações práticas. (como mostrado na Figura 1)
Figura 1
A otimização das condições de reação para alcançar um alto rendimento de rebaudisídeo D.
As condições da reação, incluindo pH, temperatura e concentração do substrato, podem ser otimizadas para alcançar um alto rendimento de Srevia Reb D. O estudo utilizou simulações de dinâmica molecular para investigar como a variante YojK-I241T/G327N potencializa a glicosilação Reb D. A variante manteve uma ligação de hidrogênio estável entre Reb A e H14 durante as simulações, ao contrário do tipo selvagem (como mostrado na Figura 2). Essa estabilidade também se estendia à distância entre o átomo de O2 do Reb A e o C1P do UDPG. A eficiência catalisadora aprimorada da variante YojK-I241T/G327N foi atribuída a essas interações estáveis, sugerindo seu potencial prático.
Figura 2
Figura 3
Conclusão
Essa abordagem resultou em 83,47% de Reb D. Notavelmente, adicionar 1 mM de UDPG permitiu a síntese de 20,59 g/L de Reb D com um notável rendimento de 91,29%, superando estudos anteriores. Esse processo demonstra o potencial para a produção em escala industrial do Reb D, especialmente após a engenharia estrutural de YojK.YojK pode ser expresso de forma eficiente em E. coli BL21 (DE3) com alta solubilidade. Por meio de engenharia guiada por estruturas, um mutante duplo, YojK-I241T/G327N, foi criado, permitindo a produção em larga escala do Reb D com rendimento excepcional de 91,29% por reciclagem de UDPG catalisada pela sacarose sintase AtSuSy. Este estudo apresenta o YojK-I241T/G327N como uma ferramenta promissora para a produção industrial em escala econômica do Reb D.
