Reação para alcançar um alto rendimento Stevia Rebaudioside D (Reb D) de Reb A

Dietas ricas em açúcar levaram a um aumento da prevalência de várias doenças crônicas, incluindo obesidade, diabetes, doenças cardiovasculares e hipertensão, representando um importante problema de saúde pública global. Stevia Rebaudioside D (Reb D), um adoçante natural derivado de plantas, ganhou atenção significativa como um substituto do açúcar devido ao seu teor zero calorias, doçura intensa e perfil de sabor agradável.
No entanto, sua presença limitada na estévia rebaudiana Bertoni e os desafios relacionados à baixa solubilidade e atividade enzimática da glicosiltransferase derivada de plantas têm dificultado sua ampla aplicação comercial. Em resposta a essas questões, uma nova glicosiltransferase chamada YojK, originária de Bacillus subtilis 168, foi descoberta. Este estudo introduz uma glicosiltransferase bacteriana geneticamente modificada, YojK-I241T/G327N, caracterizada por alta solubilidade e eficiência catalítica, oferecendo grande potencial para produção em escala industrial de Reb D.

Desenvolvimento de um método altamente eficiente para a produção de rebaudiosídeo D utilizando uma reação em cascata das enzimas YojK-I241T/G327N e AtSuSy.

Para abordar a questão da baixa solubilidade em glicosiltransferases derivadas de plantas, os pesquisadores investigaram o potencial do uso de YojK, uma O-glicosiltransferase de Bacillus subtilis 168. YojK foi escolhido por causa de sua atividade de glicosilação demonstrada com vários substratos, incluindo moléculas grandes. Após expressão recombinante e purificação bem-sucedidas, YojK foi empregado para glicosilato Reb A, resultando na produção de Stevia Reb D. A análise cinética enzimática revelou que YojK tem menor atividade catalítica em relação a Reb D em comparação com outras glicosiltransferases. Consequentemente, o estudo sugere a necessidade de engenharia guiada por estrutura para melhorar a atividade catalítica do YojK para potenciais aplicações práticas. (como mostra a Figura 1)

Figura 1

A otimização das condições de reação para alcançar um alto rendimento de rebaudiosídeo D.

As condições de reação, incluindo pH, temperatura e concentração de substrato, podem ser otimizadas para alcançar um alto rendimento de Srevia Reb D. O estudo usou simulações de dinâmica molecular para investigar como a variante YojK-I241T/G327N aumenta a glicosilação de Reb D. A variante manteve uma ligação de hidrogênio estável entre Reb A e H14 durante as simulações, ao contrário do tipo selvagem (como mostrado na Figura 2). Essa estabilidade também se estendeu à distância entre o átomo de O2 de Reb A e o C1P da UDPG. A melhor eficiência catalítica da variante YojK-I241T/G327N foi atribuída a essas interações estáveis, sugerindo seu potencial prático.

Figura 2

Os pesquisadores utilizaram uma reação em cascata envolvendo as enzimas YojK-I241T/G327N e AtSuSy. As principais etapas de otimização incluíram a manutenção do pH em 8,0 em tampão fosfato de potássio, uma temperatura de reação de 35°C, 10% de DMSO co-solvente e uma concentração de sacarose de 400 mM. (como mostra a Figura 3)

Figura 3

Conclusão

Esta abordagem produziu 83,47% Reb D. Notavelmente, a adição de 1 mM UDPG permitiu a síntese de 20,59 g/L Reb D com um notável rendimento de 91,29%, superando estudos anteriores. Este processo demonstra o potencial para a produção de Reb D em escala industrial, especialmente após a engenharia estrutural da YojK.
YojK pode ser eficientemente expressa em E. coli BL21 (DE3) com alta solubilidade. Através de engenharia guiada por estrutura, um mutante duplo, YojK-I241T/G327N, foi criado, permitindo a produção em larga escala de Reb D com um rendimento excepcional de 91,29% através da reciclagem UDPG catalisada pela sacarose sintase AtSuSy. Este estudo apresenta o YojK-I241T/G327N como uma ferramenta promissora para a produção de Reb D em escala industrial economicamente eficaz.